隨著生物醫(yī)學研究對復雜組織結(jié)構(gòu)和功能的深入探索，高分辨率、高信噪比的深組織成像技術(shù)變得愈加重要。傳統(tǒng)的顯微鏡技術(shù)往往局限于二維、透明的生物薄樣本的觀測，這在很大程度上無法滿足當前生物醫(yī)學領(lǐng)域?qū)θS深組織體成像的研究需求。

光片熒光顯微鏡憑借其低光損傷、高采集速率、大視場、體成像等優(yōu)點被生物學家廣泛使用。然而，生物組織固有的高散射特性仍然為深層成像帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

南京理工大學周笑團隊在《激光與光電子學進展》發(fā)表文章，重點介紹了光片熒光顯微成像技術(shù)在深組織成像領(lǐng)域的*進展，特別是應(yīng)對高散射樣本挑戰(zhàn)的解決策略，旨在為相關(guān)領(lǐng)域的研究人員提供有價值的參考，助力其對該前沿技術(shù)的*進展和應(yīng)用前景的理解。

光片熒光顯微鏡

的基本原理與挑戰(zhàn)

1.基本原理

成像方式：光片熒光顯微鏡采用照明與探測正交的方式進行三維圖像采集。激光從一側(cè)對樣品照明激發(fā)，在與照明光路垂直的方向探測熒光。這種方式與傳統(tǒng)熒光顯微成像技術(shù)相比，只激發(fā)焦點處的熒光，有效減少了離焦熒光信號的干擾，從而降低了光漂白與光毒性，同時也減少了背景噪聲，極大地提升了成像質(zhì)量。

光片熒光顯微成像原理圖和散射成因及影響。（a）照明與探測結(jié)構(gòu)；（b）兩種光片生成方式；（c）光入射到Z0處的散射情況；（d）散射后熒光微球的三維PSF

光片形成及影響因素：

• 照明光路：主要用于光片的形成，其厚度決定了系統(tǒng)的光學切片能力。常見的光片形成方法有柱面透鏡聚焦形成靜態(tài)高斯光片和使用掃描振鏡在物鏡焦平面快速移動聚焦光束形成動態(tài)的虛擬光片（如數(shù)字掃描光片顯微鏡DLSM）。靜態(tài)高斯光片厚度一般為幾微米到十幾微米，提供低光毒性照明但軸向分辨率受制約，成像速度慢且可能不均勻照明，對厚樣品成像深度有限；動態(tài)光片將照明能量集中在單線上，可實現(xiàn)更均勻照明，光片厚度可達亞微米級別，獲得更高軸向分辨率，受散射影響小，成像質(zhì)量高且速度快。

• 探測光路：決定了系統(tǒng)橫向分辨率，并與光片厚度共同影響系統(tǒng)的軸向分辨率。

2.面臨挑戰(zhàn)

組織散射限制穿透深度：生物組織固有的高散射特性是深層成像的主要障礙。物理散射由組織結(jié)構(gòu)中的細胞和纖維等散射體引起，光在傳播路徑上被這些結(jié)構(gòu)阻礙發(fā)生偏折和散射。同時組織內(nèi)的吸收發(fā)色團會吸收部分光能，導致光強度衰減。光的散射與吸收共同作用，使得光學顯微鏡通常只能觀察到組織表面幾十到幾百微米的范圍。

高散射樣本成像質(zhì)量問題：在觀測如大腦或心臟的厚層切片和腫瘤組織等高散射生物樣本時，樣本內(nèi)部復雜結(jié)構(gòu)和光學異質(zhì)性導致光片在樣品內(nèi)產(chǎn)生嚴重的散射與吸收，進而引起圖像模糊或失真。光片熒光顯微鏡從側(cè)面一次照亮整個平面的照明方式，還會使采集的數(shù)據(jù)中存在條紋偽影，降低圖像質(zhì)量，同時散射會減弱焦點處熒光信號，降低圖像對比度。

主要技術(shù)進展

1.激發(fā)光調(diào)制

無衍射光束應(yīng)用：研究人員采用貝塞爾光束以及其他無衍射光束代替高斯光束。貝塞爾光束在傳播過程中能保持較小束腰尺寸，且具備“自我修復”特性，即使在高散射介質(zhì)中也能保持較長的均勻光片，有效減少對組織內(nèi)部成像時的畸變。

例如Planchon等采用掃描貝塞爾光束形成比高斯光束有效長度長3-5倍的光片。艾里光束能產(chǎn)生比相同數(shù)值孔徑的高斯或貝塞爾光束更薄的光片，雖然其不對稱激發(fā)模式可能導致圖像略顯模糊或扭曲，但通過反卷積算法處理可恢復細節(jié)。華中科技大學團隊提出的雙環(huán)調(diào)制選擇平面照明顯微鏡（IDDR-SPIM）和科學西安光機所團隊提出的互補光束相減光片熒光顯微成像技術(shù)（CBS-LSFM）等進一步優(yōu)化了貝塞爾光束的應(yīng)用，減少了圖像偽影，提高了軸向分辨率與信噪比。

近紅外激發(fā)光優(yōu)勢：較長波長的近紅外光具有更長的散射平均自由程，在生物組織中傳播時更不容易被介質(zhì)中的小顆粒散射，從而實現(xiàn)更深的組織穿透。

例如Wang等利用近紅外二區(qū)光片顯微鏡對小鼠腦組織成像，1320nm激發(fā)光能夠在甘油清除的腦組織中進行較深和較寬的光學切片成像。目前已開發(fā)多種在近紅外二區(qū)發(fā)射的熒光探針，促進了其在心血管疾病、腦部病變和癌癥小鼠模型成像中的應(yīng)用，但開發(fā)適用于該光學窗口的探針仍具挑戰(zhàn)性。

3種不同模式的光片及近紅外激發(fā)策略。（a）~（c）高斯、貝塞爾、艾里光片；（d）不同光束類型的光片沿著x軸的傳播情況及熒光微球的*強度投影圖像；（e）3種波長的激發(fā)光在小鼠腦組織中的穿透深度對比

2.多視圖融合

多角度信息獲取及融合：多視圖融合技術(shù)通過同時獲取樣本不同視角或不同光路的成像信息，并利用融合算法對樣本進行三維重建，有效降低了散射的影響，提高了深組織成像的質(zhì)量。

多視圖融合光片顯微系統(tǒng)設(shè)計。（a）順序多視圖SPIM系統(tǒng)原理圖；（b）不同方向的斑馬魚融合圖像；（c）雙向照明SPIM系統(tǒng)原理圖；（d）不同深度斑馬魚腦部圖像及其放大區(qū)域圖像；（e）同步多視圖SPIM系統(tǒng)原理圖；（f）果蠅合胞胚胎重建圖像

不同方法及應(yīng)用案例：*原始的方法是旋轉(zhuǎn)樣本并從不同角度采集圖像，如Huisken等采用該方法實現(xiàn)了基因和蛋白質(zhì)表達模式的高分辨率三維可視化。Ahrens等使用雙物鏡激發(fā)系統(tǒng)提供更均勻的照明平面，有效去除偽影，其軸向分辨率比單向選擇平面照明顯微鏡提高了2倍，且成像速度更快。

華中科技大學龔輝教授團隊利用雙光束照明和共焦雙縫檢測提高圖像信噪比和質(zhì)量。為解決順序多視圖成像的時空偽影問題，研究人員開發(fā)了同步多視圖選擇平面照明顯微鏡（SiMView-SPIM）等技術(shù)，可實現(xiàn)幾乎完整的樣本覆蓋，成像速度大幅提高，還有其他如各向同性選擇平面照明顯微鏡（IsoView SPIM）、多視圖選擇平面照明顯微鏡（MuViSPIM）和四透鏡光片顯微鏡等技術(shù)也在一定程度上優(yōu)化了系統(tǒng)參數(shù)，應(yīng)用于胚胎發(fā)育等多個研究領(lǐng)域。

3.非線性光學

非線性光學效應(yīng)原理及應(yīng)用：非線性光學效應(yīng)是在高光強條件下光與物質(zhì)相互作用出現(xiàn)的非線性響應(yīng)，如雙光子吸收（2PA）、二次諧波發(fā)生（SHG）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS），其中雙光子吸收在生物成像中應(yīng)用*廣泛。雙光子顯微鏡基于雙光子吸收效應(yīng)構(gòu)建，其發(fā)光原理是“同時”吸收兩個光子形成一個分子進入激發(fā)態(tài)，再回到基態(tài)釋放出熒光。這種非線性激發(fā)只激發(fā)焦點處熒光，顯著減弱了光的散射和吸收，相比于傳統(tǒng)的單光子寬場熒光顯微鏡，能夠?qū)崿F(xiàn)更深的組織穿透和更*的光學切片，通常采用紅外激發(fā)進一步增強組織穿透能力。

雙光子光片顯微鏡的優(yōu)勢及應(yīng)用：雙光子光片顯微鏡將非線性激發(fā)與正交照明相結(jié)合，已成為深組織成像的金標準。它在生物組織中提供至少2倍的穿透深度，同時受散射效應(yīng)的影響更小。例如Fahrbach等將雙光子激發(fā)與光片顯微鏡結(jié)合，對比線性和非線性熒光激發(fā)貝塞爾光束，證明了非線性激發(fā)對旁瓣的抑制作用。Wolf等利用雙光子光片顯微鏡對斑馬魚腦部組織樣本成像，北京大學陳良怡課題組開發(fā)的雙光子三軸數(shù)字掃描光片顯微鏡等都展示了其在成像中的*性能，已*應(yīng)用于多種生物學研究領(lǐng)域。

非線性光學效應(yīng)。（a）三種非線性效應(yīng)；（b）線性與非線性激發(fā)特性；（c）線性與非線性熒光激發(fā)下貝塞爾光束的Z軸剖面圖；（d）熒光微球的線性與非線性激發(fā)成像對比；（e）斑馬魚幼蟲的全腦區(qū)域單光子與雙光子激發(fā)成像對比

4.波前校正

自適應(yīng)光學原理及應(yīng)用：自適應(yīng)光學*初用于天文望遠鏡，其核心原理是利用動態(tài)元件如可變形鏡或空間光調(diào)制器進行波前控制，校正成像系統(tǒng)產(chǎn)生的相位畸變，減少系統(tǒng)由光學元件及樣品本身引起的像差，從而優(yōu)化成像系統(tǒng)的性能。波前的校正可通過直接波前傳感技術(shù)或迭代的無傳感器方法實現(xiàn)。

波前校正。（a）探測光路中加入可變形鏡的自適應(yīng)光片顯微系統(tǒng)光路圖；（b）有無自適應(yīng)光學校正的轉(zhuǎn)基因斑馬魚圖像對比；（c）基于AutoPilot框架的自適應(yīng)成像系統(tǒng)的自由度和工作流程圖；（d）斑馬魚幼體中腦區(qū)域自適應(yīng)校正和未校正的圖像對比；（e）自適應(yīng)晶格光片系統(tǒng)光路圖；（f）斑馬魚胚胎脊骨自適應(yīng)校正前后的切片比較

在光學顯微鏡中，自適應(yīng)光學已成為校正像差和恢復衍射極限分辨率的重要工具。應(yīng)用于光片顯微鏡方面，Bourgenot等采用無波前傳感器的方法，在探測光路中加入可變形鏡對轉(zhuǎn)基因斑馬魚成像，極大提高了成像質(zhì)量，特別是成像深度。Royer等提出基于AutoPilot框架的時空自適應(yīng)成像方法，可從多個角度捕捉高分辨率生物樣本圖像，提高空間分辨率和信號強度。還有其他研究將晶格光片顯微鏡與自適應(yīng)光學相結(jié)合，實現(xiàn)了亞細胞過程的無像差成像。

5.樣品處理

早期嘗試及局限：在生物學成像領(lǐng)域，早期研究人員嘗試通過調(diào)整物鏡浸沒介質(zhì)的折射率來降低組織的散射，以增強光片的穿透能力，但這種方法在提高樣品透明度和穿透能力方面效果有限。

組織透明化和膨脹技術(shù)：組織透明化技術(shù)著重于將生物樣本脫水處理，并用與脂質(zhì)膜折射率相匹配的油代替水以減少光散射，可使組織變得透明便于顯微成像，如Dodt等采用該方法結(jié)合雙向照明光片熒光顯微成像技術(shù)實現(xiàn)了對小鼠整個大腦的成像。

樣品處理。（a）未處理和經(jīng)過透明化處理的肺葉對比；（b）組織膨脹前后的小鼠大腦對比；（c）雙向照明光片成像系統(tǒng)光路圖；（d）由550張光學切片重建的小鼠大腦；（e）部分海馬區(qū)域的三維重建圖像；（f）果蠅神經(jīng)纖維和突觸結(jié)構(gòu)的三維重建圖像；（g）小鼠大腦血管網(wǎng)絡(luò)的三維重建圖像

針對組織透明化過程中可能對某些蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)造成破壞的問題，研究人員進一步開發(fā)了組織膨脹技術(shù)，該技術(shù)可在保持組織結(jié)構(gòu)的同時均勻地將樣品物理放大，使原本低于光學顯微鏡分辨率的細節(jié)特征能夠可視化。例如Gao等將膨脹顯微鏡與分辨率晶格光片顯微鏡結(jié)合，實現(xiàn)了小鼠和果蠅大腦的近納米級成像，西湖大學高亮教授團隊提出的多功能平鋪光片顯微鏡通過組織膨脹處理提高了分辨率。

深組織光片熒光顯微

成像應(yīng)用

1.發(fā)育生物學

實時活體成像優(yōu)勢：光片熒光顯微鏡因其低光毒性和光損傷特性，成為實時活體樣本成像的理想選擇，*初主要應(yīng)用于發(fā)育生物學領(lǐng)域。

應(yīng)用案例及成果：Keller等利用數(shù)字掃描光片顯微鏡實現(xiàn)了對斑馬魚胚胎發(fā)育初期細胞核定位和運動的亞細胞分辨率成像；Chhetri等開發(fā)的各向同性多視圖光片熒光顯微鏡實現(xiàn)了對果蠅原腸受精胚胎發(fā)育過程的多視圖反卷積成像；McDole等開發(fā)的自適應(yīng)成像框架可對小鼠胚胎從原腸胚形成到早期器官發(fā)育的過程進行成像；Daetwyler等同時對多個斑馬魚胚胎樣品進行成像，為定量研究生物過程提供了基礎(chǔ)。這些方法有助于研究人員深入觀察胚胎發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)展等復雜生物過程。

光片顯微成像在發(fā)育生物學中的應(yīng)用。（a）斑馬魚胚胎發(fā)育過程中細胞和基因表達成像；（b）（c）果蠅原腸受精胚胎的多視圖成像；（d）小鼠細胞水平發(fā)育的長時間實時成像；（e）表達熒光血管標志物的斑馬魚胚胎成像

2.神經(jīng)科學

適用于神經(jīng)系統(tǒng)研究：光片熒光顯微成像技術(shù)能夠在*小的光損傷下以快速、高對比度的光學切片成像大型三維樣品，因此非常適于獲取神經(jīng)系統(tǒng)的功能成像和大腦的形態(tài)學研究。

應(yīng)用案例及成果：Ahrens等開發(fā)的同步多視圖光片顯微鏡記錄了斑馬魚大腦中幾乎所有神經(jīng)元單細胞分辨率成像；Xiao等采用晶格光片顯微鏡研究斑馬魚神經(jīng)損傷模型中細胞間的相互作用；Pan等開發(fā)的組織透明化溶液使器官和動物身體透明，結(jié)合光片顯微鏡對神經(jīng)和血管系統(tǒng)成像，可觀察單個神經(jīng)元和突觸的結(jié)構(gòu)；de Medeiros等采用四物鏡光片顯微鏡結(jié)合短紅外激光脈沖實現(xiàn)了對斑馬魚亞細胞水平的神經(jīng)元成像。這些研究有助于深入了解神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，以及實時監(jiān)測神經(jīng)活動。

光片顯微成像在神經(jīng)科學中的應(yīng)用。（a）斑馬魚全腦神經(jīng)元多視圖成像；（b）對比異基因與同基因斑馬魚的后神經(jīng)節(jié)和側(cè)線的正常與異常表達模式成像；（c）成年小鼠中央神經(jīng)系統(tǒng)成像；（d）在斑馬魚大腦中進行的單個神經(jīng)細胞體和軸突實時成像

3.組織病理學

活體組織檢查優(yōu)勢：光片顯微鏡提供了一種快速、無需切片、低光漂白、非破壞性的活體組織檢查方法，吸引了臨床病理學家的廣泛關(guān)注。

應(yīng)用案例及成果：Glaser等開發(fā)的非破壞性開放式光片顯微鏡可實現(xiàn)橫向無約束成像，用于術(shù)中對新鮮人類前列腺組織和乳腺組織的病理成像；Migliori等開發(fā)的光片θ顯微鏡從檢測物鏡同一側(cè)均勻照亮樣品，對人腦厚冠狀板進行快速高分辨率定量成像；Glaser等進一步開發(fā)的多浸入的開放式光片顯微鏡可對組織透明化的標本進行便捷的高通量成像。光片熒光顯微成像技術(shù)可幫助病理學家更好地了解組織的生長和形態(tài)變化，提高診斷疾病和分期病變的能力。

光片顯微成像在組織病理學中的應(yīng)用。（a）人類前列腺組織病理成像；（b）人類乳腺組織病理成像；（c）腎切片及單個腎小球、血管、腎小管及多通道DAPI對染成像

結(jié)論與展望

光片熒光顯微成像技術(shù)憑借其的照明和探測方式，具備低光損傷、高分辨率和快速三維體成像等特性，優(yōu)化了傳統(tǒng)顯微成像效果，成為生物醫(yī)學領(lǐng)域的重要工具。

面對生物樣本的多樣性與復雜性帶來的光散射與組織穿透能力的局限，研究人員通過多種技術(shù)優(yōu)化突破了這一難題，使其在深組織成像領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

該技術(shù)不僅能揭示單個細胞的結(jié)構(gòu)和功能，還能深入到細胞群體中觀察互動和通訊，為理解復雜生物過程提供新視角，預示著更多科研突破和醫(yī)學應(yīng)用的可能性。

聲明：本文僅用作學術(shù)目的。文章來源于:周笑, 左, 劉永燾. 深組織光片熒光顯微成像研究進展（特邀）[J]. 激光與光電子學進展, 2024, 61(2): 0211010. Xiao Zhou, Chao Zuo, Yongtao Liu. Advances in Deep-Tissue Light-Sheet Fluorescence Microscopic Imaging (Invited)[J]. Laser & Optoelectronics Progress, 2024, 61(2): 0211010.