共焦顯微測(cè)量是一種很有前景的技術(shù)，具有非接觸測(cè)量和高精度位移識(shí)別能力，廣泛應(yīng)用在芯片加工、高精密儀器制造、生物醫(yī)學(xué)、材料化學(xué)、工業(yè)檢測(cè)等領(lǐng)域。

其沿軸向位置高精度掃描的二維圖像可用于三維重建，然而，掃描的速度限制了圖像的采集速率，為了克服這一局限性，研究人員提出了許多方法對(duì)傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)。例如，基于掃描振鏡光束掃描型共焦顯微鏡、基于數(shù)字微鏡裝置的共焦顯微鏡、差分式掃描共焦顯微鏡等。

上海理工大學(xué)的毛肖肖團(tuán)隊(duì)發(fā)表文章討論了各種共聚焦顯微鏡的工作原理、物鏡類型、掃描方法、優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用。隨著光學(xué)核心部件的升級(jí)和各種準(zhǔn)確、高效算法的出現(xiàn)，未來共焦顯微鏡的掃描速度會(huì)更快、應(yīng)用范圍更廣、分辨率更高。

發(fā)展歷程與工作原理

1955年，Marvin制造出了*臺(tái)共聚焦顯微鏡，為這一技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。1984年，Molesini等基于波長(zhǎng)位移編碼原理構(gòu)建了表面輪廓儀，進(jìn)一步推動(dòng)了共焦技術(shù)的發(fā)展。此后，彩色共焦技術(shù)不斷更新和擴(kuò)展應(yīng)用，眾多科研人員在這一領(lǐng)域不斷探索，使得共焦顯微鏡技術(shù)逐漸成熟。

1.激光共焦顯微鏡

激光共焦顯微鏡是在普通顯微鏡的基礎(chǔ)上引入了“共焦技術(shù)”和 “激光掃描技術(shù)”。它以激光束為光源，激光通過照明針孔和準(zhǔn)直透鏡形成平行光，然后從分光鏡反射到物鏡并聚焦在樣品上，在焦平面中對(duì)樣品進(jìn)行逐點(diǎn)X-Y軸掃描，探測(cè)器獲得二維圖像。由于光路中探測(cè)針孔和照明針孔存在共軛關(guān)系，只有聚焦在焦平面上的點(diǎn)才能在探測(cè)針孔處成像，焦平面外的點(diǎn)不會(huì)干擾成像。通過調(diào)整聚焦平面在Z軸上的位置，可獲得一系列光學(xué)切片圖像用于三維重建。

激光共焦顯微鏡示意圖

2.彩色共焦顯微鏡

彩色共焦系統(tǒng)采用復(fù)色光源，探測(cè)器通過接收不同波長(zhǎng)的光信號(hào)還原出被測(cè)表面的三維形貌。復(fù)色光進(jìn)入系統(tǒng)后，因色散物鏡的色散作用會(huì)聚焦在不同軸向位置，只有聚焦在焦平面上的光才能進(jìn)入探測(cè)器，其余雜散光被針孔遮擋。通過改變焦平面位置，就能獲取樣品不同深度的表面信息。通常將共焦反射顯微鏡放置在焦平面處，利用三維位移控制器改變物體位置，用CCD采集一系列不同深度二維圖像，*進(jìn)行三維重建。

簡(jiǎn)化的彩色共焦顯微鏡模型

共焦顯微系統(tǒng)的組成

1.色散物鏡

色散物鏡是共焦系統(tǒng)的核心部件，其設(shè)計(jì)方式主要有折射式和衍射式。

折射式色散物鏡：光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)成熟，加工簡(jiǎn)單，價(jià)格合理，便于色散，早期應(yīng)用廣泛。不同研究人員通過各種透鏡組合設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了不同的色散和測(cè)量效果。例如，在不同波長(zhǎng)范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了不同的色散值和軸向分辨率，以及不同的測(cè)量范圍和精度。

衍射式色散物鏡：其色散特性與傳統(tǒng)折射光學(xué)器件相反，色散效果更明顯。為提高系統(tǒng)性能，常將折射和衍射透鏡組合使用。此外，菲涅爾透鏡也具有優(yōu)勢(shì)，如更好的線性度、可折疊等，但在寬波段成像方面還需進(jìn)一步探索。

色散物鏡

2.光源

共焦顯微鏡的照明針孔和探測(cè)針孔具有共軛關(guān)系，這一特性實(shí)現(xiàn)了三維空間濾波，可獲得高空間分辨率的光學(xué)切片。針孔直徑對(duì)成像的亮度和分辨率有重要影響，需綜合考慮信噪比和光通量。在不同樣本的共焦成像光路系統(tǒng)中，還需考慮針孔尺寸的調(diào)節(jié)和光路對(duì)準(zhǔn)問題。對(duì)于彩色共焦技術(shù)，光源的選擇尤為重要，白光光源可能會(huì)有能量損失影響信噪比，而連續(xù)光譜光源雖能擴(kuò)展量程但價(jià)格昂貴。

3.共焦針孔

共焦針孔的大小需謹(jǐn)慎選擇。如果針孔尺寸過大，系統(tǒng)橫向分辨率將與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相同，軸向精度降低；尺寸過小則會(huì)影響光的通過，導(dǎo)致光強(qiáng)度損失，降低測(cè)量精度。為了實(shí)現(xiàn)針孔的快速、準(zhǔn)確以及可重復(fù)定位，開發(fā)了如圓形針孔電動(dòng)線性陣列等多種改變針孔尺寸的系統(tǒng)。

共焦成像掃描方法

1.基于掃描振鏡光束掃描型共焦顯微鏡

該系統(tǒng)使用激光作為點(diǎn)光源，通過兩個(gè)可控制轉(zhuǎn)動(dòng)角度的轉(zhuǎn)向振鏡，分別對(duì)樣品進(jìn)行X和Y方向的逐點(diǎn)掃描獲取二維圖像，*終實(shí)現(xiàn)三維重建。這種掃描方式避免了機(jī)械移動(dòng)，提高了掃描速率，橫向分辨率是普通顯微鏡的2倍。但逐點(diǎn)掃描方式降低了測(cè)量效率，且探測(cè)器接收到的反射信號(hào)微弱，需使用靈敏度高的光電倍增管。

2.旋轉(zhuǎn)Nipkow圓盤掃描共焦

1884年德國(guó)科學(xué)家Nipkow等提出Nipkow轉(zhuǎn)盤法，1960年被應(yīng)用在共焦顯微鏡中。利用旋轉(zhuǎn)Nipkow圓盤的掃描共焦是基于多光束掃描的方法，可以實(shí)時(shí)成像。光源發(fā)出的光穿過被測(cè)物體聚焦的共軛平面上的針孔，形成多個(gè)點(diǎn)光源照射在樣品表面，反射光在CCD上成像，配合圓盤高速旋轉(zhuǎn)實(shí)現(xiàn)快速二維成像。由區(qū)域檢測(cè)器獲取2D圖像，能形成真實(shí)共焦圖像，但轉(zhuǎn)盤對(duì)針孔尺寸和位置要求嚴(yán)格，不能改變系統(tǒng)分辨率，且系統(tǒng)復(fù)雜昂貴。

3.基于微透鏡陣列的共焦顯微鏡

基于微透鏡陣列的顯微成像可降低雜散光影響，提高三維圖像重構(gòu)分辨率，還能提高光能利用率、擴(kuò)大視場(chǎng)。其原理是將針孔陣列放置在分束鏡前，光源穿過針孔形成光源陣列照明物體表面，通過區(qū)域相機(jī)CCD捕捉反射的針孔圖案來確定高度，進(jìn)而重建3D表面。但存在相鄰針孔串?dāng)_問題，隨著針孔間距減小，信噪比和深度分辨率降低，也會(huì)限制3D成像的橫向分辨率。

4.基于數(shù)字微鏡裝置的共焦顯微鏡

數(shù)字微鏡裝置（DMD）由微反射鏡組成陣列，可覆蓋具有數(shù)百萬(wàn)個(gè)單獨(dú)控制像素的2D區(qū)域。將DMD用作光束調(diào)制器件，可獲得可編程針孔陣列，替代分束鏡。經(jīng)過光束整型后的平行光通過DMD反射到色散透鏡，*用CCD采集圖像信息。DMD可調(diào)整采樣點(diǎn)，控制掃描速率，但進(jìn)行共焦測(cè)量時(shí)縱、橫向分辨率會(huì)比使用微透鏡陣列時(shí)下降。

5.差分式掃描共焦顯微鏡

20世紀(jì)90年代國(guó)外相關(guān)技術(shù)已成熟，其原理是從物體表面反射的光束被一分為二，分別聚焦到放置在焦前和焦后的兩個(gè)探測(cè)器上，對(duì)接收的軸向強(qiáng)度響應(yīng)曲線進(jìn)行差分計(jì)算獲取變化信息。這種方式通過檢測(cè)光學(xué)焦點(diǎn)改進(jìn)了信噪比和軸向分辨率，抑制了噪聲，軸向分辨率雙倍提高，且不需要橫向掃描，可實(shí)現(xiàn)樣品表面輪廓的高速測(cè)量。

6.基于掃描源的彩色共焦顯微鏡

該顯微鏡采用波長(zhǎng)掃描激光器連續(xù)、重復(fù)地產(chǎn)生與寬帶光源等效波長(zhǎng)的光，經(jīng)色散物鏡聚焦在被測(cè)物體上，由光電探測(cè)器接收發(fā)射光。系統(tǒng)不再使用光譜儀接收反射光，而是根據(jù)時(shí)間尺度反復(fù)獲得反射光的光譜信息，*終解碼光譜信息獲得物體表面信息。與常規(guī)CCM相比，可提高三維輪廓檢測(cè)速率。

共焦成像顯微鏡中的各種掃描方法

共焦成像掃描方法

1.三維重建

在傳統(tǒng)共焦顯微鏡中，通過計(jì)算軸向響應(yīng)的峰值強(qiáng)度確定物體軸向位置，常用的標(biāo)準(zhǔn)峰值波長(zhǎng)提取算法存在誤差，研究人員提出了多種改進(jìn)方法。在彩色共焦顯微鏡中，可將彩色相機(jī)替代光電探測(cè)器作為接收端，利用光學(xué)層析特性，通過記錄不同深度截面圖像重構(gòu)物體完整圖像，需將RGB顏色模型轉(zhuǎn)換為合適模型并通過算法實(shí)現(xiàn)與波長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

2.透明材料檢測(cè)

彩色共焦顯微鏡可對(duì)光學(xué)透明、半透明或弱散射材料進(jìn)行斷層深度剖面、多層成像和缺陷檢查及厚度測(cè)量，檢測(cè)層間界面處反射光后可提供準(zhǔn)確薄膜厚度信息，且不會(huì)損壞樣品。但測(cè)量過程中會(huì)因材料色散出現(xiàn)信號(hào)混疊、串?dāng)_等情況，降低信噪比，影響測(cè)量精度。需要對(duì)材料色散的誤差進(jìn)行理論分析，建立補(bǔ)償模型提高測(cè)量精度。

半（透明）材料檢測(cè)

3.工業(yè)集成檢測(cè)

在精密領(lǐng)域中，表面粗糙度是重要參數(shù)。彩色共焦法對(duì)被測(cè)物體表面的紋理、傾斜、顏色等外界因素不敏感，具有良好抗干擾性，精度高，易于集成，適合工業(yè)現(xiàn)場(chǎng)的表面粗糙度測(cè)量和在線檢測(cè)。例如，基于CCM開發(fā)的集成在微加工機(jī)床上的掃描系統(tǒng)，可在有振動(dòng)環(huán)境下實(shí)現(xiàn)高精度測(cè)量，還可實(shí)現(xiàn)加工-測(cè)量一體化功能。

工業(yè)集成檢測(cè)應(yīng)用

4.生物醫(yī)學(xué)成像

共焦顯微鏡在組織和細(xì)胞水平上對(duì)癌癥成像具有很大前景，熒光反射共焦顯微鏡是一種無創(chuàng)光學(xué)成像方法，可準(zhǔn)確分辨組織并檢查皮膚細(xì)節(jié)，已被證明能高靈敏度和特異性診斷皮膚癌。還可結(jié)合其他生物技術(shù)用于多種生物醫(yī)學(xué)研究，如拍攝熒光圖像、全景掃描組織、觀察細(xì)胞代謝等。

共焦顯微在細(xì)胞生物學(xué)的應(yīng)用

5.其他應(yīng)用

共焦顯微鏡的三維成像還應(yīng)用于日常安全運(yùn)輸中的變形監(jiān)測(cè)、金屬厚度評(píng)估等領(lǐng)域。

共焦顯微在其他領(lǐng)域的應(yīng)用

結(jié)與展望

傳統(tǒng)的共焦測(cè)量法曾受視野和實(shí)時(shí)測(cè)量局限，掃描速率和精度受限。隨著計(jì)算機(jī)和激光技術(shù)的快速發(fā)展，以及對(duì)光源選型和色散透鏡分辨能力的深入研究，出現(xiàn)了多點(diǎn)并行的掃描方式，提高了二維信息采集速度和三維成像速度。

彩色共焦法因省略軸向步驟等優(yōu)勢(shì)，逐漸成為多個(gè)領(lǐng)域不可或缺的工具。相信在未來，共焦顯微鏡的掃描速度會(huì)更快、應(yīng)用范圍更廣、分辨率更高，為微觀世界的探索提供更強(qiáng)大的支持。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來源于:毛肖肖, 趙斌, 董祥美, 高秀敏. 共焦顯微鏡技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 光學(xué)儀器, 2024, 46(1): 82. Xiaoxiao MAO, Bin ZHAO, Xiangmei DONG, Xiumin GAO. Confocal microscope technology and application[J]. Optical Instruments, 2024, 46(1): 82.