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單物鏡光片三維熒光成像技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用
光片顯微鏡由于具有強(qiáng)大的光學(xué)層切能力、較快的成像速度和較低的光損傷,成為三維成像的重要工具。光片顯微鏡通常利用兩個(gè)垂直放置的物鏡分別進(jìn)行照明和成像,這帶來(lái)了對(duì)樣品的空間限制并禁用了高數(shù)值孔徑的成像物鏡。
以?xún)A斜平面照明和微鏡微器件反射技術(shù)為代表的單物鏡光片顯微技術(shù)突破上述限制,展示出在高分辨率和體積高速成像方面的優(yōu)勢(shì),并且可與分辨顯微術(shù)等多種技術(shù)結(jié)合,在近年來(lái)取得了巨大發(fā)展。
科學(xué)技術(shù)大學(xué)的張一凡團(tuán)隊(duì)發(fā)表綜述文章《單物鏡光片三維熒光成像技術(shù)研究進(jìn)展(特邀)》,介紹了單物鏡光片顯微成像技術(shù)的原理、關(guān)鍵性能的提升和其在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用。
光片顯微鏡概述
光學(xué)顯微鏡是生命科學(xué)研究的重要工具。20世紀(jì)80年代,共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡出現(xiàn),賦予了顯微鏡三維解析能力,但存在光毒性和光漂白問(wèn)題。
2004年,光片顯微鏡(LSM)出現(xiàn),其激發(fā)光經(jīng)柱透鏡在樣品上形成光片,限制了照明范圍,減少了光損傷和光漂白。2008年,數(shù)字激光掃描顯微鏡(DLSM)是另一種形成光片的方法。
傳統(tǒng)光片顯微鏡由照明光路和探測(cè)光路組成,通常需要兩個(gè)正交的物鏡。但雙物鏡的使用帶來(lái)了一系列問(wèn)題,如樣品裝載手段復(fù)雜、不能使用常用載玻片、限制樣品種類(lèi)和安裝,需要物鏡有較長(zhǎng)工作距離,限制了高分辨率圖像的獲得,兩個(gè)光路間還需要對(duì)焦。
兩種單物鏡光片照明方式與傳統(tǒng)光片的照明方式。(a)傳統(tǒng)的光片顯微鏡,兩個(gè)物鏡正交放置,一個(gè)用于照明,一個(gè)用于成像;(b)傾斜平面照明顯微鏡,直接將照明光引入物鏡,在樣品表面形成傾斜的光片,適配于載玻片裝載的常規(guī)樣品;(c)應(yīng)用于微器件通道的單物鏡光片,將傾斜45°反射微鏡設(shè)計(jì)在微器件上,形成的光片直接垂直于光軸
而以?xún)A斜平面照明和微鏡微器件反射技術(shù)為代表的單物鏡光片顯微技術(shù)突破了上述限制,并展示出了在高分辨率和體積高速成像方面的優(yōu)勢(shì)。
單物鏡光片顯微鏡
技術(shù)原理
傾斜平面照明顯微鏡(OPM)
2008年,Dunsby發(fā)明了傾斜光片照明顯微鏡。它把柱透鏡生成的片狀照明光引入原先探測(cè)物鏡的光路,同時(shí)在成像光路中設(shè)計(jì)了遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng),引入二級(jí)和三級(jí)物鏡來(lái)復(fù)制和成像樣本的三維信息。
傾斜平面照明顯微鏡光路,用同一物鏡生成光片并成像,引入遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng)修正照明角度傾斜
三維成像掃描方式
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移動(dòng)載物臺(tái)掃描:這是一種常見(jiàn)的方法,通過(guò)移動(dòng)載物臺(tái)使光片掃過(guò)樣品各部分。但它有很多缺點(diǎn),比如受樣品體積限制,運(yùn)動(dòng)不穩(wěn)定會(huì)耗時(shí),還會(huì)引入運(yùn)動(dòng)偽影影響圖像質(zhì)量。后來(lái)Kumar等進(jìn)行了改進(jìn),把物鏡壓電移動(dòng)平臺(tái)安裝在二級(jí)物鏡處,通過(guò)移動(dòng)二級(jí)物鏡來(lái)改變光片位置實(shí)現(xiàn)三維掃描,提高了成像速度。
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利用檢流計(jì)振鏡掃描:這種方法可以使照明光片快速掃過(guò)樣本。例如Bouchard等開(kāi)發(fā)的平面掃面共焦(SCAPE)顯微鏡,利用定制六邊形振鏡大大提高了三維成像速度。之后還有很多改進(jìn)的掃描方式,像SOPI-OPM、SCAPE 2.0等,它們?cè)谔岣咚俣鹊耐瑫r(shí)也不斷優(yōu)化成像效果。
幾種光片的掃描方式示意圖。(a)SCAPE 1.0;(b)OS-2P-LSFM;(c)SOPI、eSPIM、DOPM和SCAPE 2.0
多視圖光片成像
在實(shí)際成像過(guò)程中,光片穿過(guò)樣品會(huì)因?yàn)樯⑸洹⑽盏葐?wèn)題導(dǎo)致光衰減,尤其是在腦組織等復(fù)雜生物樣品中,散射會(huì)讓圖像質(zhì)量下降很快。多視圖光片顯微鏡就可以解決這個(gè)問(wèn)題,它利用兩個(gè)或多個(gè)不同方向的光片照明,獲得多個(gè)視角的圖像,再通過(guò)圖像融合算法把這些圖像組合起來(lái),減少散射引起的偽影,得到各向同性分辨率的圖像。
基于微鏡反射的單物鏡光片顯微鏡
針尖微懸臂反射鏡
2013年,Gebhardt等開(kāi)發(fā)了利用原子力顯微鏡(AFM)臂的反射型光片顯微鏡,斜入射的光片在壁上反射照明樣品。2018 年,Ponjavic等利用原子力顯微鏡的單臂也開(kāi)發(fā)了一種單物鏡光片顯微鏡。
微流控制備微反射鏡器件
2015年,Galland等設(shè)計(jì)了一款特別的單物鏡光片顯微鏡。它不需要遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng),光片方向垂直于物鏡光軸。它使用定制的樣品裝載容器,把45°反射微鏡放在硅片的微孔里。照明光束從物鏡后焦面斜入射,經(jīng)反射后形成垂直光軸的照明光片。這個(gè)顯微鏡還可以和倒置商用標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡兼容,能使用多種物鏡,生成不同厚度的光片,滿(mǎn)足多種尺度的研究需求。
單物鏡光片顯微鏡
關(guān)鍵性能提升
空間分辨率
OPM雖然解決了正交光片顯微鏡不能使用高數(shù)值孔徑物鏡的問(wèn)題,但實(shí)際使用中,物鏡的高數(shù)值孔徑并不能完全被利用。這是因?yàn)檎彰鞴馐鴷?huì)分占一部分?jǐn)?shù)值孔徑,而且遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng)中第二物鏡與第三物鏡傾斜放置,導(dǎo)致光不能完全中繼到第三物鏡上。
不過(guò),研究人員也找到了一些解決辦法,比如E-OPM通過(guò)在三級(jí)物鏡之前增加類(lèi)似“水箱”的設(shè)計(jì),利用水和空氣的折射率差,把更多光折射進(jìn)三級(jí)物鏡,提高了數(shù)值孔徑的利用率。
OPM中的數(shù)值孔徑減小與分辨率仿真。(a)初級(jí)物鏡的照明角度與收集的關(guān)系圖解;(b)不同傾斜角度下有效光瞳面積的示意圖,其中NA=1.4,折射率n=1.52;(c)NA=1.30,1.40,1.49,傾斜角分別為0°、30°、60°、90°的情況下對(duì)PSF進(jìn)行仿真的結(jié)果
成像視場(chǎng)
三級(jí)物鏡遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng)對(duì)顯微鏡的視場(chǎng)范圍有影響。光片顯微鏡的軸向分辨率和視場(chǎng)是相互制約的。在傾斜光片顯微鏡中,遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng)是視場(chǎng)限制的主要原因。
為了增大視場(chǎng),研究人員想出了很多方法,比如擴(kuò)展平面成像、利用反射閃耀光柵、利用Scheimpflug條件等,還有一些新穎的方案是取消遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng)。
幾種提升OPM性能的方法。(a)玻璃*的三級(jí)物鏡;(b)利用微鏡陣列增加分辨率;(c)加入微透鏡陣列,通過(guò)計(jì)算方法直接成像;(d)二級(jí)光錐損失示意圖,低數(shù)值孔徑物鏡光錐全部丟失,引入光柵反射對(duì)光束進(jìn)行重新定向;(e)插入橢球鏡改善視場(chǎng)
單物鏡光片顯微鏡
在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用
傾斜平面照明顯微鏡的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用
光片顯微鏡因?yàn)楣舛拘缘停1挥糜诨铙w胚胎等大樣本的長(zhǎng)時(shí)間發(fā)育成像。單物鏡光片顯微鏡更是把振鏡掃描方式引入光片顯微鏡的三維成像,極大地提高了體積成像速度。
這對(duì)于神經(jīng)活動(dòng)、心臟跳動(dòng)及血流動(dòng)力學(xué)等高速生命活動(dòng)的觀測(cè)非常有幫助。比如可以對(duì)心臟中的鈣火花進(jìn)行3D成像,觀察心肌細(xì)胞收縮活動(dòng)中的鈣波傳輸?shù)取?/span>
它還可以用于高通量成像,像結(jié)合聲流控聚焦設(shè)計(jì)多色3D成像流式細(xì)胞術(shù),同時(shí)對(duì)多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方面,也有應(yīng)用,比如開(kāi)發(fā)了Medi-SCAPE用于活體腫瘤監(jiān)測(cè),還應(yīng)用于眼科成像,對(duì)眼底視網(wǎng)膜進(jìn)行三維成像,檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)等。
傾斜平面照明顯微鏡用于快速生命活動(dòng)成像。(a)OPM實(shí)現(xiàn)對(duì)心臟中鈣火花的3D成像;(b)OPM實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌收縮鈣波傳播的觀測(cè);(c)SCAPE 2.0以321 volume/s的體積成像速度實(shí)現(xiàn)對(duì)心臟與心房間的血流動(dòng)力學(xué)觀測(cè)
OPM在生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)檢查場(chǎng)景的廣泛應(yīng)用。(a)OPM的高分辨率成像;(b)OPM用于流式細(xì)胞檢測(cè);(c)DaXi-OPM實(shí)現(xiàn)對(duì)9個(gè)斑馬魚(yú)胚胎的同時(shí)成像;(d)Medi-SCAPE用于活體腫瘤檢測(cè);(e)利用人眼作為天然物鏡,實(shí)現(xiàn)對(duì)眼底視網(wǎng)膜成像
基于微鏡反射的單物鏡光片顯微鏡的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用
這類(lèi)顯微鏡可以使用高NA物鏡對(duì)多孔板進(jìn)行成像,移動(dòng)位移臺(tái)時(shí)不需要重新聚焦樣品。
它與倒置商用標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡兼容,能滿(mǎn)足多種應(yīng)用需求。比如在生物微器件研究中,可以用于類(lèi)器官培養(yǎng),獲取全細(xì)胞分辨圖像,開(kāi)發(fā)流式細(xì)胞術(shù)等。
微鏡反射的單物鏡光片顯微鏡。(a)基于45°微鏡的單物鏡光片顯微鏡的光路,右上角為掃描電子顯微圖像;(b)利用ETL進(jìn)行軸向位移,使光片中心橫向位置保持不變
單物鏡光片顯微鏡
的分辨成像拓展
單分子定位分辨成像
典型的單分子方法如STORM,單分子分辨方法中熒光信號(hào)微弱,圖像信噪比越高,單分子定位精度越高。光片顯微鏡具有低背景熒光的優(yōu)勢(shì),與單分子定位技術(shù)結(jié)合后,可將厚樣本納入研究范圍,在多種單物鏡光片架構(gòu)中都有應(yīng)用。
結(jié)合單分子定位方法的單物鏡光片顯微鏡。(a)soSPIM-PLAM成像,左邊寬場(chǎng),右邊分辨;(b)soSPIM-dSTORM分辨成像,左邊寬場(chǎng),右邊分辨;(c)組織深度為 50 μm的代表性體積obSTORM圖像,十張圖像堆疊,深度顏色編碼;(d)obSTORM高傾斜角度的光片入射;(e)光片角度下理論和實(shí)驗(yàn)PSF的對(duì)比
結(jié)構(gòu)光照明分辨成像
SIM分辨顯微術(shù)具有相對(duì)較快的速度,與光片技術(shù)常用于活細(xì)胞的成像場(chǎng)景。單物鏡的架構(gòu)為結(jié)構(gòu)光帶來(lái)了新機(jī)遇,如2022年Chen等的設(shè)計(jì)用一個(gè)帶有振鏡與靜態(tài)鏡組合的圖像旋轉(zhuǎn)器的單物鏡光片顯微鏡,可獲得各向同性的分辨圖像。
分辨結(jié)構(gòu)光的傾斜平面照明顯微鏡。(a)同一顯微鏡下寬場(chǎng)成像和結(jié)構(gòu)光分辨成像對(duì)比;(b)三個(gè)方向,每個(gè)方向拍攝3張不同相位的圖片進(jìn)行重建獲得分辨圖;(c)SIM-OPM結(jié)構(gòu)光分辨顯微鏡光路簡(jiǎn)圖
結(jié)論與展望
光片顯微鏡因光學(xué)切片及與多種光學(xué)技術(shù)的適用性而迅速發(fā)展。單物鏡光片顯微術(shù)有諸多優(yōu)點(diǎn),解決了傳統(tǒng)光片顯微鏡的載玻片使用、幾何空間限制及正交光片顯微鏡不能用高NA物鏡的問(wèn)題,聯(lián)合分辨成像技術(shù)后分辨水平進(jìn)一步提升,推動(dòng)了其在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用,適用于高速生命活動(dòng)觀察和在體成像場(chǎng)景,是快速體積成像利器。
聲明:本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來(lái)源于:張一凡, 李輝, 楊光. 單物鏡光片三維熒光成像技術(shù)研究進(jìn)展(特邀)[J]. 激光與光電子學(xué)進(jìn)展, 2024, 61(6): 0618014. Yifan Zhang, Hui Li, Guang Yang. Advances in Single-Objective Light Sheet Three-Dimensional Fluorescence Imaging (Invited)[J]. Laser & Optoelectronics Progress, 2024, 61(6): 0618014.